非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

【兽药名称】

通用名称：非洲猪瘟病毒荧光 PCR 检测试剂盒（B 盒）

汉语拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名称：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名称：无

【作用与用途】

用于血液、血球粉、淋巴结、脾脏、扁桃体中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

【用法与判定】

1.用法

1.1 样品处理

血液样品直接用；淋巴结、脾脏、扁桃体样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 2.0g 于研钵中充分研磨，再加 10.0mL PBS（pH7.2，含 1 万单位青霉素和 1 万单位链霉素）混匀（样品不足 2.0g 按 1:5 比例加 PBS），对处理的待检样品置 70℃，30 分钟灭活后，3000r/min，4℃离心 5 分钟，取上清液，编号备用；血球粉处理同上，只不过省掉研磨步骤。

1.2 样品存放

采集或处理好的样品在 2℃～8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存，须放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过 3 次）。

1.3 操作步骤

1.3.1 病毒 DNA 的提取

病毒 DNA 的提取推荐使用本公司生产的非洲猪瘟病毒荧光PCR 检测试剂盒（A 盒），操作步骤参照说明书。如客户自备提取试剂，请参考相应提取试剂的使用说明书进行操。提取好的 DNA 须在 2h 内进行 PCR 扩增，若需长期保存须放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融。

1.3.2 荧光 PCR 扩增（使用 B 盒）

（1）从试剂盒中取出荧光 PCR 反应液、Taq 酶，室温融化后，2000r/min 离心 5 秒。设所需 PCR 管数为 n（n=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照），每个测试反应体系需要 20μL 荧光PCR 反应液和 0.5μL Taq 酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个 PCR 管中各分装20μL。

（2）分别向上述 PCR 管中加入 1.3.1 中制备的 DNA 溶液各5μL，盖紧管盖，500r/min 离心 30 秒。

（3）将加样后的 PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内，作好标记。

反应参数设置：

第一阶段，预变性 95℃/3 分钟

第二阶段，95℃/10 秒，60℃/30 秒共 45 个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的 60℃延伸时进行。

2.判定

2.1 结果分析条件的设定

阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。对于多通道荧光 PCR 仪，选定 FAM（465-510）检测通道读取检测结果，ABI 仪器选择FAM 无荧光淬灭基团。

2.2 质控标准

2.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。

2.2.2 阳性对照的 Ct 值应≤28，并出现典型的扩增曲线。

2.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。

2.3 结果判定

2.3.1 阴性：无 Ct 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。

2.3.2 阳性：Ct 值≤38.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。

2.3.3Ct 值＞38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。

批准文号:兽药生字191478858