猪轮状病毒抗体检测试剂盒（间接ELISA）

介绍

猪轮状病毒病（Rotavirus,RV）抗体检测试剂盒用于检测猪血清中的RV抗体，评估养猪场RV疫苗免疫状况及感染猪的血清学辅助诊断。

本试剂盒采用间接ELISA法，在酶标板条微孔上预包被纯化的RV病毒抗原。在试验中，加入稀释后的待检血清，经过温育后，若样品中含有RV病毒特异性抗体，则与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔中加入TMB底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm波长测定反应孔中的吸光度A值。

组份

需自备的设备及试剂

1. 微量移液器： 0.5µl-10µl、10µl-100µl、100µl-1000µl。

2. 一次性移液器吸头。

3. 量筒：500ml。

4. 96孔板酶标仪。

5. 蒸馏水或去离子水。

6. 洗瓶或洗板机。

样品制备

取动物全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。

洗涤液的准备

浓缩洗涤液使用前应恢复至室温，如有盐结晶，摇动使结晶的盐溶解，然后用蒸馏水或去离子水作10倍稀释。稀释好的洗涤液可在4℃存放一周左右。

样品的稀释

在血清稀释板中按1：100的体积比稀释待检血清。

注意：阴性和阳性对照不用稀释。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品在加入到包被板微孔前应充分混匀。

注意事项

1. 试剂盒使用前各试剂应平衡至室温，应将试剂盒各组份放置室温至少1小时以上。使用前应摇匀，使用后放回2-8℃。

2. 不同品种、不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染。

3. 底物和终止液对皮肤和眼可能有刺激性，使用时应该注意防护。

4. TMB（显色液）不要暴露于强光和避免接触氧化剂。

5. 检测板拆封后应避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥剂放于自封袋中，并尽快置于2-8℃)。

6. 所有废弃物在丢弃之前应合理处理以免污染。

7. 严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时和洗涤等的全部过程必须精确。

8. 血清稀释板为一次性用品，不得重复使用；血清稀释板的最大容量为300μl/孔。

操作步骤

1. 取预包被的检测板（根据样品多少，可拆开分次使用），将稀释好的待检血清取100μl加入到检测板孔中。同时设阴性对照1孔，阳性对照2孔，取阴性及阳性对照各100μl分别加入反应孔中，轻轻振匀孔中样品（勿溢出）。

2. 盖上封板膜（可按实际需要自行裁剪），置37℃温育30分钟。

3. 小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作浓度洗涤液每孔加250ul，后甩去孔内液体，以上步骤重复4-6次，最后在干净吸水纸上拍干。

4. 每孔加酶结合物50μl，盖上封板膜，置37℃温育30分钟。

5. 小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗涤4-6次, 方法同3。切记最后在干净吸水纸上拍干。

6. 每孔加显色液100µl，轻微震荡混匀、盖上封板膜37℃闭光显色10分钟。

7. 每孔加终止液50μl，使反应终止，10分钟内测定结果。

结果判定

用酶标仪于450nm（630nm作参比波长）读取吸光度A值。

试验成立的条件是：

阴性对照（N）OD值<0.20，同时阳性对照（P）OD值〉0.4。

计算方法：

样品OD值÷阳性对照OD均值=S/P值

阴阳性判断：

S/P值≥0.4判断为阳性；

S/P值<0.4判断为阴性。

贮存方法： 2 - 8ºC下贮存。

有效期： 12个月。