新型冠状病毒PCR 检测试剂盒

【产品名称】新型冠状病毒PCR检测试剂盒

【包装规格】50T/盒

【使用范围】该试剂盒用于使用咽拭子，鼻咽拭子，肺泡灌洗液，痰液样品定性检测新型冠状病毒（2019-nCoV）。该试剂盒的检测结果仅供临床参考，不应作为临床诊断的唯一标准。建议结合患者的临床表现和其他实验室检查对病情进行全面分析。

【测试原理】该试剂盒基于一步式RT-PCR技术。选择2019年新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab和N基因作为扩增目标区域。设计了特异性引物和荧光探针（N基因探针用FAM标记，ORF1ab探针用HEX标记），用于检测样品中的2019年新型冠状病毒RNA。该试剂盒还包括一个内源性内部控制检测系统（内部控制基因探针标记有CY5），用于监测样本收集，RNA和PCR扩增的过程，从而减少假阴性结果。

【主要成分】

自备试剂：RNA提取或纯化试剂。

阴性/阳性对照：阳性对照是包含靶标片段的RNA，阴性对照是无核酸水。在使用过程中，它们应参与提取，并应被视为传染性物质。它们应按照有关规定进行处理和处置。

内参基因为人RnaseP基因。

【保存条件和有效期】-20±5℃，有效期6个月，反复冻融次数不应超过5次。

【适用仪器】拥有FAM/HEX/CY5等多通道荧光PCR仪。

【标本要求】

1.适用的样本类型：鼻/咽拭子、痰、肺泡灌洗液。

2.标本采集（无菌技术）

咽拭子：同时用两根拭子擦拭扁桃体和咽后壁，然后将拭子头浸入装有采样液的试管中；

痰：患者深咳后，将咳嗽的痰收集在装有采样液的螺帽试管中；

肺泡灌洗液：由专业的医务人员进行采集。

3.样品的储存和运输

用于病毒分离和RNA检测的标本应尽快进行测试。24小时内可检测到的标本可在4℃下保存；那些在24小时内无法检测到的物品应存放在-70℃或以下（如果没有-70℃的存放条件，则应暂时存放在-20℃冰箱中）。标本应避免在运输过程中反复冻结和解冻。标本应在收集后尽快送到实验室。如果样品需要长距离运输，建议使用干冰进行存储。

【测试方法】

1  样本处理和RNA提取（样本处理区）

建议取200μl液体样品进行RNA提取，相关提取步骤参照商品化RNA提取试剂盒说明书进行操作。该试剂盒中的阴性和阴性对照均参与提取。

2  PCR试剂制备（试剂制备区）

2.1  从试剂盒中取出所有组份在室温解冻后，摇动并混合。使用前以8,000 rpm离心几秒钟；计算试剂所需量，反应体系配制见下表：

2.2  彻底混合各组分后，短时间离心以使管壁上的所有液体落到管底部，然后将20 µl扩增系统等分到PCR管中

3  采样（标本准备区）

分别添加5μl提取后阴、阳性对照，待测标本的RNA到PCR反应管中，盖紧管，并在8,000 rpm离心数秒后，将其转移至扩增检测区域。

4  PCR扩增（扩增检测区）

4.1将反应管放入仪器的样品池中，参数设定如下：

5  结果分析（请参考各仪器的使用说明书进行设置）

反应后，保存结果。分析后根据图像调整基准线的起始值，终止值和阈值（用户可以根据实际情况进行调整，起始值可以设置为3〜15，终止值可以设置为5〜20，调整）在对数图窗口的阈值处，使阈值线处于对数阶段，阴性对照的扩增曲线为直线或低于阈值线）。

6  质量控制

阴性对照：FAM、HEX、CY5检测通道没有明显的扩增曲线;

nCOV阳性对照：FAM和HEX检测通道的明显扩增曲线，Ct值≤32；

在同一实验中必须同时满足以上要求；否则，该实验无效，需要再次进行。

7  结果的确定

7.1  若测试样品的FAM和HEX通道中没有扩增曲线或Ct值> 40，CY5通道中存在扩增曲线，则可以判断样品中没有新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA；

7.2   若测试样品为人真实样本且FAM、HEX和CY5通道中均没有扩增曲线或Ct值> 40，则可以判断此次实验无效，需重新测试；

7.3   若测试样品在FAM和HEX通道中具有明显的扩增曲线，且Ct值≤40，则可以判断该样品对新型冠状病毒（2019-nCoV）呈阳性。

7.4  若测试样品仅在FAM或HEX的一个通道中具有明显的扩增曲线，且Ct值≤40，而另一个通道中没有扩增曲线，则需要重新测试结果。如果重新测试结果一致，则可以判断该样品对新型冠状病毒（2019-nCoV）呈阳性。如果重新测试结果是否定的，则可以判断该样品对新型冠状病毒（2019-nCoV）呈阴性。

【测试结果的解释】

1.每次实验均应测试阴性和阳性对照。只有当对照满足质量控制要求时，才能确定测试结果

2.当FAM和HEX检测通道为正时，由于系统竞争，来自CY5通道（内部控制通道）的结果可能为负。

3.当内部控制结果为负时，如果试管的FAM和HEX检测通道也为负，则表明系统被禁止或操作错误，则测试无效。因此，样品需要重新测试。

【测试方法的局限性】

1.样品测试结果与样品采集，处理，运输和存储的质量有关。不合理的样品采集，转移，存储和处理可能会导致错误的测试结果。

2.样品处理过程中交叉污染控制不佳，可能会出现假阳性结果。

3.在流行期间，病毒的基因突变也可能导致假阴性结果。

4.此试剂盒的测试结果仅供临床参考。应结合患者的症状/体征，病史，其他实验室检查和治疗反应来考虑患者的临床诊断和治疗。

【产品性能指标】

产品分析性能评估结果：

1  该试剂盒的分析灵敏度为103拷贝/ ml。

2.交叉反应：不与其他病原体发生交叉反应，例如地方性人类冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、人类基因组DNA与2019年新型冠状病毒相似或引起类似症状。

3.外源性干扰物质：标本中针对患者可能使用的治疗药物，如粘蛋白，苯福林、羟甲唑啉、氯化钠（含防腐剂）、倍氯美松、地塞米松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、α-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、阿奇霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、妥布霉素均不会干扰试剂盒的测试结果。

4.痰和咽拭子标本中可能存在的内源性物质，例如全血和粘液，不会影响试剂盒的测试结果。

5.精度：批内/批间精度，日内/日常精度，不同操作者之间的精度变异系数（CV）不大于5％。

6.阴性/阳性参照物的符合率：3种阳性参照物和10种阴性参照物的符合率均为100％。

7.将临床评价结果与通过新型冠状病毒感染的肺炎患者诊治方案和通过新型冠状病毒感染的肺炎患者监测方案（第二版）中通过推荐方法获得的确认/排除结果进行比较。分析了解放军总医院海南医院，广东省疾病预防控制中心等8家医疗机构的实际使用情况。通过初步分析，基本确定了该产品的临床性能可以满足流行情况的紧急需求。用于临床评估的样品类型包括咽拭子和痰液。产品上市后将收集更多临床数据，以确认其临床性能。

【注意事项】

1  本产品仅用于体外测试。实验前请仔细阅读说明。

2  为了避免样本中任何潜在的生物危害，应将样本视为具有传染性，并避免与人体皮肤和粘膜接触；标本应在生物安全柜中处理，以防止气溶胶流出。样品制备区域中使用的试管和尖端应倒入盛有消毒剂的容器中，并与医疗废物一起消毒后再丢弃。样品处理和加工必须符合当地相关规定。

3  产品加工：PCR后，该产品很可能造成污染。所有的反应管应由当天不再参与实验的人员放入生物安全垃圾处理袋或其他容器中，然后在完全密封后丢弃。

4  在整个过程中避免RNase污染。实验期间，请穿着工作服，一次性手套和口罩。在通风良好的化学通风橱或生物安全柜中完成操作，该柜要用紫外线清洁，消毒和灭菌，以防止任何有害物质进入呼吸道。

5  使用高压灭菌的一次性离心管和吸头，或购买无DNase和RNase的离心管和吸头。

6  使用前要完全解冻PCR检测试剂，并在8000 rpm离心几秒钟后使用，但要避免反复冻融。

7  如果在样品处理过程中不能很好地控制交叉污染，则可能会出现假阳性结果。

8  实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范进行。实验室人员必须接受专业培训。实验过程应严格划分为不同区域（试剂制备区，标本制备区，扩增试验区）。所有消耗品均应消毒一次使用。实验的每个阶段均应使用专用仪器和设备。每个阶段的每个区域的用品都不得交叉使用。

9  实验结束后，应使用10％的次氯酸盐或75％的酒精对工作台和移液器进行消毒，然后将其置于紫外线下20-30分钟。

10   RNA样品提取完成后，建议立即进行下一个实验。否则，请将提取物储存在-20℃以便使用（24小时内）；

11  必须对每个实验进行质量控制。

12  各种因素可能会导致试剂在存储，运输和使用过程中性能发生变化，例如不正确的存储和运输，非标准样品采集，样品处理和测试。请严格遵守说明。由于样品采集过程的特征（例如，用棉签采样和病毒感染过程本身），可能由于采集的样品不足而导致假阴性结果。因此，应结合其他临床诊断和治疗信息对检测结果进行综合判断，必要时应进行重新检测。