猫传染性腹膜炎病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)

产品编号:CP007

检测方法:荧光PCR

检测样品:鼻,咽式子

规格:25T/50T


  

猫传染性腹膜炎病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)




【产品名称】

通用名称:猫传染性腹膜炎病毒检测试剂盒(实时荧光PCR法)

英文名称:Feline Infectious Peritonitis virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】 25T/ 50T/

【预期用途】

本试剂盒适用于猫传染性腹膜炎病毒检测,不进行病毒分型,可用于临床猫传染性腹膜炎病毒感染的辅助诊断,但不作确诊使用。

【检验原理】

本试剂盒针对引起猫传染性腹膜炎病毒基因组高度保守区域设计特异性引物和探针,在反应体系中含猫传染性腹膜炎病毒基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

【主要组成成份】

序号

组成

25头份/

50头份/

1

FIPV RT-PCR反应液及酶混合液

20 μL×25

20 μL×50

2

FIPV 阴性对照

40 μL×1

40 μL×1

3

FIPV 阳性对照

40 μL×1

40 μL×1

4

说明书

1

1

注:阴性对照为猫基因组DNA,阳性对照为失去活性的猫冠状病毒cDNA

【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1.样品取鼻拭子、咽拭子和粪便标本,采集方法如下:

(1) 鼻拭子:将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入2-4 ml采样液中,尾部弃去。

(2) 咽拭子:用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,同样将棉签头浸入2-4 ml采样液中,尾部弃去。

(3) 粪便标本:采集1-10g粪便(或用塑料杆人造纤维头的肛拭子两支)放入含有10 ml PBS或生理盐水无菌的50ml有螺旋盖的塑料瓶内,密封,4℃条件下立即送至有关实验室。

2.血液或血清样品:使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。

3.应避免标本间交叉污染。

【检验方法】

1. 试剂准备(试剂准备区)

a.计算当次实验所需要的反应数,从-20℃以下冰箱保存的试剂盒中取等量8PCR反应管(内装有PCR反应液),平衡至室温;预留一管作为阴性对照一管作为阳性对照。

b.将实验所需的8PCR反应管转移至样本处理区。

2.样本准备(样本处理区)

QIAGENRoche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。

3.加样

a.取出8PCR反应管试剂,瞬时离心以去除管壁附着液体。

b.打开反应管管盖,在液封层上(切勿插入底部)加入5 μL处理好的样本重悬液;阴性对照和阳性对照管则各加5 μL阴性对照或阳性对照品;

c.盖好PCR反应管盖,瞬时离心以去除管壁附着液体。

d.记录模板加样顺序。将PCR反应管转移到PCR扩增区进行PCR检测。

4.PCRPCR扩增区)

1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。

2)按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。

反应体积

25 μL

通道选择

FAM通道采集FIPV荧光信号

PCR

反应

条件

步骤

条件

循环数

反转录

42℃10分钟(min

1

预变性

95℃3分钟(min

1

预扩增

95℃5秒(s

5

55℃40秒(s

PCR扩增

95℃5秒(s

40

55℃40秒(s

(此阶段结束时采集荧光信号)

注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正,设置淬灭基团选择None

【参考值(参考范围)】

1.试剂盒有效性判定:

1)阳性对照:有典型S型扩增曲线或Ct≤35

2)阴性对照:Ct值>38或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。

2.标本结果判定:

1)阳性:标本检测结果Ct≤35或有明显指数增长期。

2)可疑:标本检测结果Ct值在3538范围内。此时应 对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在3538范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。

3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。

【检验结果的解释】

通道及检测结果

标本检测结果解释

FAM

+

标本中检出FIPV病毒RNA

-

标本中未检出FIPV病毒RNA

【检验方法的局限性】

1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的最低检出限时可能会发生假阴性的结果。

2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。

3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染,则容易得到假阳性结果。

【产品性能指标】 产品的最低检出限为102 Copies/mL,产品CV≤5%

【注意事项】

1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。

2. 为避免RNA降解,样本处理过程应在0-4℃条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。

4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀,并应瞬时离心。

5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。

6. 为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在PCR反应管上进行任何标记。

7. 仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置;不同批号试剂不能混用。

8. ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正,淬灭基因选择None

9. 实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。

 


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