猪瘟抗体检测试剂盒(阻断ELISA)

clas

sical swine fever,CSF）抗体检测试剂盒用于检测猪血清中的猪瘟抗体，评估猪场猪瘟疫苗免疫状况。

ELISA法，在酶标板条微孔上预包被猪瘟抗原。在试验中，加入稀释后的待检血清，经过温育后，若样品中含有猪瘟抗原特异性抗体，则与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标的抗猪瘟抗体，样本中的抗体阻断了酶标抗体与包被板上抗原的结合；经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔中加入TMB底物液，经酶催化产生的蓝色信号与样本中的抗体含量成反比，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm波长测定反应孔中的吸光度A值。

需自备的设备及试剂

1. 微量移液器：10µl-100µl、100µl-1000µl。

2. 一次性移液器吸头。

3. 量筒：500ml。

4. 96孔板酶标仪。

5. 蒸馏水或去离子水。

6. 洗瓶或洗板机。

样品制备

取动物全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。

洗涤液的准备

浓缩洗涤液使用前应恢复至室温，如有盐结晶，摇动使结晶的盐溶解，然后用蒸馏水或去离子水作10倍稀释。稀释好的洗涤液可在4℃存放一周左右。

注意事项

1. 试剂盒使用前各试剂应平衡至室温，应将试剂盒各组份放置室温至少1小时以上。使用前应摇匀，使用后放回2-8℃。

2. 不同品种、不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染。3. 终止液对皮肤和眼可能有刺激性，使用时应该注意防护。

4. TMB（显色液）不要暴露于强光和避免接触氧化剂。

5. 检测板拆封后应避免受潮或沾水(未用完的抗原包被板加干燥剂放于自封袋中，并尽快置于2-8℃)。

6. 所有废弃物在丢弃之前应合理处理以免污染。

7. 严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时和洗涤等的全部过程必须精确。

8. 抗原包被板为一次性用品，不得重复使用；

操作步骤

1. 每次试验均设置阳性对照1孔、阴性对照2孔，阴、阳性对照不用稀释，直接取100ul加入反应孔。

2. 将样品稀释液按80ul/孔加入到微孔反应板内，之后将待检样品血清按20ul/孔加入孔内并吹打混匀（移液器枪头请勿混用）；

3. 盖上封板膜（可按实际需要自行裁剪），置37℃温育60分钟。

4. 小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作浓度洗涤液每孔加250ul，后甩去孔内液体，以上步骤重复4-6次，最后在干净吸水纸上拍干。

5. 每孔加酶结合物100μl，盖上封板膜，置37℃温育30分钟。

6. 小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗涤4-6次, 方法同4。切记最后在干净吸水纸上拍干。

7. 每孔加显色液100µl，混匀、盖上封板膜37℃闭光显色

15分钟。

1. 每孔加终止液50μl，使反应终止，10分钟内测定结果。

结果判定

用酶标仪于450nm（630nm作参比波长）读取吸光度OD值。

试验成立的条件是：

阴性对照（N）OD值>0.5，同时阳性对照（P）阻断率>50%；

计算方法：

PI (阻断率)=  1 —（样品OD值 ÷ 阴性OD均值）

阴阳性判断：

当PI(阻断率)>40%则判断为阳性；

PI=<40%且PI>30%为可疑；

当PI<=30%则判断为阴性。

贮存方法： 2 - 8ºC下贮存。

有效期： 12个月。