新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒

【产品名称】

通用名称：新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒

英文名称：Newcastle disease virus RT-PCR Detection Kit

【包装规格】 10人份/盒 & 50人份/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于新城疫病毒检测，可用于临床新城疫病毒感染的辅助诊断，但不作确诊使用。

【检验原理】

利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环，最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的扩增带。

【主要组成成份】

注：阴性对照为鸡基因组DNA，阳性对照为失去活性的新城疫病毒cDNA。

【储存条件及有效期】-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。

【需自备的物品】

1.仪器：分析天平、离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。

2.耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌1.5mL离心管和吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）、灭菌双蒸水。

【注意事项】

1.病毒具有很强的感染能力，操作前必须准备好各种防御措施。

2.操作时须严格按照步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，以免污染实验室和工作人员。

3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性，必须使用不含DNA和RNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套，操作人员须戴口罩。

4.Buffer V-L、Buffer V-N和Buffer W1A含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。

【实验准备】

第一次使用时，请在Buffer W1 A和Buffer W2 concentrate中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇；

准备异丙醇（1%冰乙酸）：即99ml异丙醇中加入1ml冰乙酸，混合均匀，室温密闭储存；

如果是提取病毒RNA，请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。

【操作步骤】

1.样本要求：

(1) 活禽样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：

① 咽喉拭子，采取时要将拭子深入喉头及上愕裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液；

② 泄殖腔拭子，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便；

③ 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理盐水的离心管中备用。

(2) 血液或血清样品：使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。

(3) 肌肉或内脏样品：取少量样品（2～3克）于研钵或匀浆器中研磨，然后将研磨匀浆转入无菌离心管中，3000rpm/min 离心10分钟取上清待检。

(4) 应避免标本间交叉污染。

(5) 标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融。

2. 样品处理：每份样品分别处理。

（1）无细胞体液样品处理：收集200 µL样品，转入到1.5 ml离心管中；

（2）全血样品处理：待血凝后取血清 200 µL , 转入到1.5 ml离心管中；

（3）组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g ，用手术剪碎混匀后取 ，用手术剪碎混匀后取 0.05 g于研磨器中，加入1.5 mL生理盐水继续充分研磨，待匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中，12,000 rpm离心 5 min，取上清液 200 µL 于1.5 mL离心管中。

3. 提取过程：

（1）向上一步转入样品的1.5 mL的离心管中，加入200 µL Buffer V-L，涡旋振荡混合均匀，静置5 min。

（2）加入75 µL Buffer V-N，涡旋振荡混合均匀后，于12,000 rpm离心5 min。

（3）将上清液转移到新的2mL离心管（试剂盒内已提供）中，加300 µL异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均匀。

（4）将制备管置于2ml离心管（试剂盒内提供）中，取上一步骤中的混合液移入制备管中，6,000 rpm离心1 min。

（5）弃滤液，将制备管放回到2 ml离心管中，加入500 µL Buffer W1A（确认已按要求加入无水乙醇），室温静置1min，于12,000rpm离心1 min。

（6）弃滤液，将制备管放回到2 ml离心管中，加入800 µL Buffer W2（确认已按要求加入无水乙醇），于12,000 rpm离心1 min。

（7）将制备管放回到2 ml离心管中，12,000 rpm离心1 min。

（8）将制备管置于洁净的1.5 ml离心管（试剂盒内已提供）中，在制备管膜中央加入40-60 µL Buffer TE（nuclease-free），室温静置1min，于12,000rpm离心1-2min洗脱DNA/RNA。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要DNA/RNA浓度较高，可以将洗脱的DNA/RNA再次过柱离心洗脱一次；或适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30 μl，体积过小降低洗脱效率，减少RNA产量。

4. RT-PCR扩增

每份总体积20 µL，含15 µL RT-PCR反应液（用前混匀），3µL 混合酶液，2 µL模板RNA。

例如：n份样品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反应液， 3×（n+1）混合酶液匀后取18 µL分装成n份，分别加入2 µL模板RNA，作好标记。

在PCR扩增仪上进行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循环94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

5. 电泳

称1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液100 mL（取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至100 mL），于微波炉中熔解，再加入50 µL染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

【结果判定】

阳性对照出现244 bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现244bp扩增带为新城疫病毒阳性，否则为阴性。