禽流感病毒（通用型）RT-PCR检测试剂盒

【产品名称】

通用名称：禽流感病毒（通用型）RT-PCR检测试剂盒

英文名称：Avian Influenza virus RT-PCR Detection Kit

【包装规格】10T/盒 & 50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于禽流感病毒检测，不进行病毒分型，对禽流感病毒引起的流感及其并发症的诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环，最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的扩增带。

【主要组成成份】

注：阴性对照为禽类基因组DNA，阳性对照为失去活性的禽流感病毒cDNA。

【储存条件及有效期】-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。

【需自备的物品】

1.仪器：分析天平、离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。

2.耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20 mL一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌1.5mL离心管和吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）、灭菌双蒸水。

【注意事项】

1.病毒具有很强的感染能力，操作前必须准备好各种防御措施。

2.操作时须严格按照步骤进行，废物必须放入含消毒液的废物缸，以免污染实验室和工作人员。

3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性，必须使用不含DNA和RNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套，操作人员须戴口罩。

4.Buffer V-L、Buffer V-N和Buffer W1A含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。

【实验准备】

第一次使用时，请在Buffer W1 A和Buffer W2 concentrate中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇；

准备异丙醇（1%冰乙酸）：即99ml异丙醇中加入1ml冰乙酸，混合均匀，室温密闭储存；

如果是提取病毒RNA，请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。

【操作步骤】

样本采集：采用鼻拭子、咽拭子等方法获得样本。具体操作方法如下：

（1）鼻拭子： 操作者将沾湿的无菌拭子平行于上腭的角度轻轻地左右转动从一侧鼻孔插入至鼻道内鼻腭处，一般当拭子插入有阻力时再将拭子停留2～3s后缓慢转动退出。

（2）咽拭子：操作者一手持压舌板压住病人舌后根，另一手拿住无菌拭子根部，然后将沾湿的无菌拭子左右两面及拭子头部快速且较用力地分别刮取扁桃腺两侧及咽后壁的分泌物。

（3）将鼻拭子和咽拭子一起放人盛有1.0ml生理盐水的离心管中备用。

2. 样品处理：每份样品分别处理。

（1）无细胞体液样品处理：收集200 µL样品，转入到1.5 ml离心管中；

（2）全血样品处理：待血凝后取血清 200 µL , 转入到1.5 ml离心管中；

（3）组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g ，用手术剪碎混匀后取 ，用手术剪碎混匀后取 0.05 g于研磨器中，加入1.5 mL生理盐水继续充分研磨，待匀浆后转至1.5 mL 灭菌离心管中，12,000 rpm离心 5 min，取上清液 200 µL 于1.5 mL离心管中。

3. 提取过程：

（1）向上一步转入样品的1.5 mL的离心管中，加入200 µL Buffer V-L，涡旋振荡混合均匀，静置5 min。

（2）加入75 µL Buffer V-N，涡旋振荡混合均匀后，于12,000 rpm离心5 min。

（3）将上清液转移到新的2mL离心管（试剂盒内已提供）中，加300 µL异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均匀。

（4）将制备管置于2ml离心管（试剂盒内提供）中，取上一步骤中的混合液移入制备管中，6,000 rpm离心1 min。

（5）弃滤液，将制备管放回到2 ml离心管中，加入500 µL Buffer W1A（确认已按要求加入无水乙醇），室温静置1min，于12,000rpm离心1 min。

（6）弃滤液，将制备管放回到2 ml离心管中，加入800 µL Buffer W2（确认已按要求加入无水乙醇），于12,000 rpm离心1 min。

（7）将制备管放回到2 ml离心管中，12,000 rpm离心1 min。

（8）将制备管置于洁净的1.5 ml离心管（试剂盒内已提供）中，在制备管膜中央加入40-60 µL Buffer TE（nuclease-free），室温静置1min，于12,000rpm离心1-2min洗脱DNA/RNA。

注：洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要DNA/RNA浓度较高，可以将洗脱的DNA/RNA再次过柱离心洗脱一次；或适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30 μl，体积过小降低洗脱效率，减少RNA产量。

4. RT-PCR扩增

每份总体积20 µL，含15 µL RT-PCR反应液（用前混匀），3µL 混合酶液，2 µL模板RNA。

例如：n份样品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反应液， 3×（n+1）混合酶液匀后取18 µL分装成n份，分别加入2 µL模板RNA，作好标记。

在PCR扩增仪上进行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循环94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

5. 电泳

称1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液100 mL（取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至100 mL），于微波炉中熔解，再加入50 µL染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

【结果判定】

阳性对照出现219 bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现219 bp扩增带为禽流感病毒阳性，否则为阴性。